LC-10A高效液相色谱仪做面粉中偶氮甲酰胺含量测定

LC-10A高效液相色谱仪在面粉中偶氮甲酰胺的含量测定中的应用。摘 要：面粉中偶氮甲酰胺(azodicarbonamide，ADA)用丙酮提取，提取液氮吹浓缩后用20mmol/L乙酸铵的水溶液定容，并用正己烷脱脂。样液供高效液相色谱仪测定，外标法定量。方法的线性范围

摘 要：面粉中偶氮甲酰胺(azodicarbonamide，ADA)用丙酮提取，提取液氮吹浓缩后用20mmol/L乙酸铵的水溶液定容，并用正己烷脱脂。样液供高效液相色谱仪测定，外标法定量。方法的线性范围为0～50mg/L(r=1.000)，定量下限为1.0mg/kg。在面粉基质中分别添加1.0、2.0、50.0mg/kg 3个水平的偶氮甲酰胺标准品，方法的回收率为80～92%，相对标准偏差小于7%。关键词：面粉，偶氮甲酰胺，高效液相色谱，GE-200液相色谱仪（www.htcee.com）

偶氮甲酰胺(azodicarbonamide，ADA)是一种黄至橘红色结晶性粉末，无臭，常用于小麦粉处理剂及焙烤食品快速发酵剂。ADA为0～ 0.045g/kg时被认为无毒[1]。目前，我国GB2760《食品添加剂使用卫生标准》(含1997～2006年增补品种)规定小麦粉中ADA最大使用量为0.045g/kg。偶氮甲酰胺作为一种新型面团改良剂，可改善面团的物理操作性质及面制品组织结构[2]，在国外已广泛应用。近年来，有研究表明偶氮甲酰胺在面粉中可能代谢产生氨基脲(semicarbazide，SEM)[3]。SEM通常作为呋喃西林(nitrofurazone)的代谢物在兽药残留中检出。硝基呋喃类药物具有致突变和致癌作用， 因此，面粉中偶氮甲酰胺的快速检测方法的开发显得尤为重要。虽然我国已规定偶氮甲酰胺在面粉中的最大使用量，但目前还未见有关于面粉中ADA快速检测方法的报道，也无相关的检测标准。本文建立了面粉中ADA的高效液相色谱分析方法，该方法前处理简单，灵敏度高，能够广泛应用于面粉中ADA的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂LC-10A型高效液相色谱仪，配7725i手动进样器和；振荡器(SA400型，日本Yamato公司)；离心机(Universal 32型，德国Hettich公司)；旋涡混合器(M37610-33型，美国Barnstead公司)；吹氮浓缩仪(TASE-24)。水为去离子水；乙腈、二甲基甲酰胺为色谱纯；丙酮、正己烷为分析纯；滤膜(0.20μm， 水相)；偶氮甲酰胺标准品(纯度大于99.0%)购自美国Chemservice公司。1.2 标准溶液配制准确称量适量标准物质，用二甲基甲酰胺溶解并定容，配制成1000mg/L标准储备液，分装于液相小瓶中，在-80℃冰箱中保存，2周内使用。根据需要用20mmol/L乙酸铵的水溶液配制标准工作溶液。1.3 样品处理方法称取面粉1g(精确到0.001g)于50mL塑料离心管中，加入10mL丙酮，室温下振荡提取15min，5000r/min离心5min。取上层5mL丙酮于40℃氮吹至近干，用20mmol/L乙酸铵的水溶液定容至1mL，再加入1mL正己烷，旋涡振荡。静置分层，取下层水溶液过滤膜，立即进行液相分析。1.4 液相色谱条件色谱柱：Copsil-100-CN，250mm×416mm(i.d.)，5μm；柱温：25℃；流速：0.8mL/min；等度洗脱：20mmol/L乙酸铵的水溶液-乙腈(体积比80∶20)；检测波长：245nm；进样量：10μL。

2 结果与讨论2.1 萃取溶剂的选择偶氮甲酰胺极性较强，易溶于二甲亚砜和N，N-二甲基甲酰胺，微溶于水、醇和丙酮等有机试剂。二甲亚砜和N，N-二甲基甲酰胺虽然对偶氮甲酰胺溶解度高，但其保留时间与偶氮甲酰胺相似，会产生干扰。同时二者不易挥发，不易通过挥发除去干扰，故不适合作为提取溶剂。若用水提取，面粉中的水溶性成分也会对偶氮甲酰胺的分析造成干扰。甲醇、乙腈等作为提取溶剂所得的水溶性杂质较多，也不适合作为提取溶剂。经过比较，以丙酮作为提取溶剂，可满足微量偶氮甲酰胺的提取要求，且所提取干扰杂质较少。因此本实验选用丙酮作为萃取溶剂。2.2 净化方法的选择及优化面粉的丙酮提取液在浓缩后，分别用2种提取液定容以萃取偶氮甲酰胺，同时加入正己烷脱脂。实验比较了水-乙腈(体积比2∶8，下同)和水2种提取液，结果发现用水-乙腈(2∶8)所得谱图在偶氮甲酰胺出峰处有明显干扰，而用水提取所得HPLC谱图无干扰。因此本方法使用纯水作为萃取溶剂，同时使用正己烷除去脂质的干扰。2.3 提取液稳定性研究提取液中偶氮甲酰胺的稳定性对实验结果有很大影响。以加标50mg/kg面粉为研究对象，丙酮为溶剂提取偶氮甲酰胺，在室温(约20℃)条件下，于24h内测定提取液峰面积，考察其稳定性曲线。结果表明，所得提取物在20℃条件下， 偶氮甲酰胺提取液于24h内稳定。2.4 液相色谱条件的优化2.4.1 液相色谱柱的选择 偶氮甲酰胺在C18色谱柱上几乎没有保留，曾尝试庚烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠等离子对试剂，都无法推迟其出峰时间。因此本实验采用对极性物质有一定保留的氰基柱作为分析柱，其保留时间约5.0～6.0min，满足分析需要。2.4.2 流动相的选择 本实验以不同比例的乙腈与20mmol/L乙酸铵作流动相等度洗脱，结果发现，乙腈与20mmol/L乙酸铵体积比为2∶8时， 既能与面粉中干扰杂质分离，同时不会受二甲基甲酰胺及丙酮色谱峰的干扰，分离效果较为满意(出峰时间5.5min)，如图1。2.5 方法的线性范围、检出限与定量下限逐级稀释偶氮甲酰胺标准工作液进行HPLC分析，回归方程为y=19.7742x-1.0069(y为峰面积，x为偶氮甲酰胺的质量浓度，mg/L)，线性范围为0～50mg/L，r=1.000，定量下限为1.0mg/kg(S/N>10)。2.6 检测方法精密度与回收率选择面粉为基质，分别添加1.0、2.0、50.0mg/kg3个水平的偶氮甲酰胺标准品，每个加标水平平行测定10次。实验结果表明，方法的平均回收率在80～92%之间，方法的相对标准偏差小于7%，满足日常检测需要。空白及加标液相色谱图见图1。2.7 深圳市售面粉中偶氮甲酰胺的普查从深圳各大型购物商场购买39份不同产地面粉进行分析，均未发现含有偶氮甲酰胺。